ADSCs (Adipose-derived stem cells)의 분리 방법 및 지방 세포로의 분화
박철영

성균관의대
줄기세포(stem cell)는 적절한 신호에 의한 자기 복제 및 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 전구세포로서 발생 단계에서부터 인체의 장기를 형성하고 성장 후에는 장기 및 조직의 기능을 복원하는 데 중요한 역할을 한다. 줄기세포는 발생 초기 배반포(blastocyst)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생과정이 끝난 성체 또는 태반에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)가 있다. 이 두 가지 줄기세포는 서로 다른 특징을 가지고 있는데, 배아줄기세포는 미분화 상태에서 자가 증식 능력이 뛰어나지만 분화 잠재성을 알기 어려워 생체 내 이식을 한 경우 불필요한 세포의 증식 등 암 발생 가능성을 고려해야 한다. 또한 배아줄기세포의 이용은 생명체 이용이라는 점에서 많은 윤리적인 문제를 안고 있어 실질적인 사용에 제한이 따른다. 반면, 성체줄기세포는 생체 내에 이식된 후 장기 특성에 맞게 분화하는 특이성 및 본래의 세포 특성과는 다른 종류의 세포로 교차 분화할 수 있는 유연성을 가지고 있고, 다양한 세포로 분화될 수 있는 다잠재성이 있음이 밝혀지면서 성체줄기 세포를 통한 세포 치료의 가능성을 높아지고 있다.

성체줄기세포 중 가장 얻기 쉽고 풍부한 양을 얻을 수 있는 방법은 지방조직에서 유래하는 지방줄기세포를 분리하는 것이며, 이를 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, ASCs)라고 한다. 지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, ASCs는 배양 시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 다양한 세포로의 분화가 가능하다는 것이다. 이들 줄기세포는 지방조직뿐만 아니라 연골, 골, 신경조직, 혈관조직 등 간엽조직 재생과 간 세포, 신장, 심혈관 재생 등 다양한 조직을 재생한다는 것이 밝혀지고 있다.

현재 ASCs는 지방조직의 성숙 지방세포, 적혈구 등을 제거한 나머지 기질세포(stromal vascular fraction, SVF)를 분리 배양하여 얻는다. 그러나 이 SVF에는 지방전구세포, 지방모세포 등의 지방세포의 각 분화 단계에 따는 여러 가지 성분들이 포함되어 있다. 세포막 표면에 존재하는 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 분리하는 방법이 개발되어 있지만, 고비용으로 인하여 제한적이고 대중적으로 사용하기 어려운 단점이 있다. 인간과 동물의 장기 및 조직에서 생존율과 순도가 높은 세포를 분리하기 위한 방법으로 세포의 크기와 밀도에 기초한 방법들이 활용되고 있는데 밀도차등(density gradient) 원심분리는 죽은 세포와 뒤섞인 상태로 있는 살아있는 세포(live cell)를 분리해낼 수 있는 것으로 알려져 있으며, 주로 간세포의 분리에 이용되고 있다. 밀도차등 원심분리에 사용되는 매질로는 Percoll, metrizamide, Ficoll 400, Nycodenz, straction 등이 있는데, 비이온성 요오드 화합물인 Nycodenz는 세포 독성, 삼투압 손상 및 응집 반응이 적다고 알려져 있다.

이에 본 장에서는 SVF에서 분리 방법과 지방조직의 SVF에서 분리한 줄기세포를 지방세포, 연골세포, 뼈세포로 분화 유도하는 방법에 대해 알아보고자 한다. 특히, SVF에서 분리한 세포를 표면 항원 분석의 비용적인 측면을 고려한 새로운 방법인 Nycodenz를 이용한 밀도차등 원심분리를 이용하여 생존율과 순도가 높은 분화 및 지방세포로 분화되는 적정 구획을 찾아보고자 한다.

1. 재료
  • Bovine Serum Albumin (BSA; GibcoBRL - Cat# 30063-572)
  • Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; GibcoBRL - Cat# 24020-172)
  • Dulbecco’S Modified Eagle Medium (DMEM; GibcoBRL - Cat# 11995-065)
  • Phosphate buffered saline (PBS; GibcoBRL - Cat# 10010-023)
  • Fetal Bovine Serum (FBS; GibcoBRL - Cat# 26140-079)
  • Horse Serum (GibcoBRL - Cat# 26050-088)
  • Penicillin Streptomycin (GibcoBRL - Cat# 15140-122)
  • Trypsin-EDTA (GibcoBRL - Cat# 25200-056)
  • Fungizone (Invitrogen - Cat# 15290-018)
  • Nycodenz (Histodenz; SIGMA - Cat# D2158)
  • Red Blood Cell Lysing Buffer (RBC buffer; SIGMA - Cat# R7757)
  • Collagenase Type Ⅱ (SIGMA - Cat# C6685)
  • 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX; SIGMA - Cat# I5879)
  • Dexamethasone (Dexa; SIGMA - Cat# D4902)
  • Oil Red O (SIGMA - Cat# O0625)
  • Insulin (휴물린 알; 한국릴리)
  • Insulin Transferrin Selenium (ITS, GibcoBRL - Cat# 51500-056)
  • Transforming growth factor-β1 (TGF-β1, SIGMA - Cat# T7039)
  • LA-BSA (1.35 mg/㎖ bovine serm asbumin and 5.35 mg/㎖ linoleic acid)
  • L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate (SIGMA - Cat# A8960)
  • β-Glycerophosphate disodium salt hydrate (SIGMA - Cat# G9422)
  • Cell Strainer, 100 μm (나일론 여과지; BD Biosciences - Cat# 352360)

2. SVF (stromal vascular fraction)의 분리
  1. Rat 으로부터 지방조직 채취.
  2. 2% BSA가 첨가된 HBSS 용액으로 여러 번 세척.
  3. 작은 조직으로 분쇄.
  4. 0.075% Collagenase Type Ⅱ에 37℃에서 30분간 처리.
  5. 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin가 첨가된 DMEM으로 효소반응 정지.
  6. 100 μm 나일론 여과지 (Cell Strainer)에 filtering.
  7. 200 X g에서 10분 동안 원심분리.
  8. 상층에 부유된 지질과 지방세포층을 제거.
  9. RBC buffer에 10분간 처리.
  10. 200 X g에서 10분 동안 원심분리.
  11. SVF 수거.

※ Nycodenz를 이용한 비중에 따른 세포의 분리
  1. 농도별 비연속 Nycodenz buffer - 30, 19, 13, 11% wt/vol.
  2. 지방조직의 SVF를 11% Nycodenz buffer에 넣는다
  3. 250 X g에서 30분간 원심분리.
  4. 상층액과 각 농도별 경계면(interface)에서 수집한 SVF를 각각 Fx-1 (<11% Nycodenz), Fx-2 (11~13% Nycodenz), Fx-3 (13~19% Nycodenz), Fx-4 (19~30% Nycodenz)으로 구분.

3. 지방세포로의 분화 유도 및 확인
  1. 수집한 분획의 SVF를 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin가 첨가된 DMEM 배양액에 희석.
  2. 12 well plate에 1 X 105 cell/well seeding. 2일 간격으로 배지 교환.
  3. 100% confluency가 될 때까지 배양 (Day 0일).
  4. D0에 지방세포 분화유도를 위해 배양액에 520 uM IBMX, 1 uM Dexa, 1mg/㎖ Insulin을 첨가한 지방세포 분화유도 배지 (MDI medium, Adipogenic medium)를 2일간 처리.
  5. D2에 1mg/㎖ Insulin만을 첨가한 배지 (Insulin medium)로 다시 2일간 처리.
  6. D4에 10% FBS/DMEM로 바꾸어 준 후, 2일마다 10% FBS/DMEM로 바꾸어 주며 분화 정도를 관찰. 보통 D6~8에 지방 방울 (Lipid vacuole)의 형성 확인.
  7. 세포를 10% formaldehyde로 30분 고정 후, DW로 2~3회 세척.
  8. 60% iospropanol에 Oil Red O를 녹인 Oil Red O solution으로 60분 정도 염색.
  9. Oil Red O 용액을 제거하고, DW로 세척 한 후, 현미경으로 사진 촬영.
  10. 사진 촬영 후, 염색된 lipid droplet은 100% iospropanol로 Oil Red O de-stain을 하여 ELISA reader로 490nm에서 흡광도를 측정.

4. 근육세포로의 분화 유도 및 확인
  1. 수집한 분획의 SVF를 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin가 첨가된 DMEM 배양액에 희석.
  2. 12 well plate에 1 X 105 cell/well seeding. 2일 간격으로 배지 교환.
  3. 80% confluency가 될 때까지 배양.
  4. 근육세포 분화유도를 위해 배양액에 5% horse serum, 50uM hydrocortisone을 첨가한 근육세포 분화유도 배지를 7일간 처리.
  5. 2일마다 근육세포 분화유도 배지로 바꾸어 주며 분화 정도를 관찰.

5. 연골세포로의 분화 유도 및 확인
  1. 수집한 분획의 SVF를 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin가 첨가된 DMEM에 배양.
  2. 배양중인 세포를 0.25% Trypsin-EDTA 용액으로 배양접시에서 떼어낸 후, 연골세포 분화유도배지 (50㎖ DMEM 배지당 0.5㎖ 100X ITS, 50㎕ LA-BSA, 0.2mM L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate, 100nM Dexa, 10ng/㎖ TGF-β1)를 이용하여 4 X 105 세포가 포함되도록 희석.
  3. 세포 희석액을 10㎖ conical tube에 0.5㎖씩 분주한 후, 상온에서 5분간 500Xg 속도로 원심분리하여 세포덩어리를 만든다.
  4. 세포덩어리를 37℃, 5% CO2가 유지되는 세포배양기에서 3주간 배양. 이때 배양액은 연골세포 분화 유도배지를 이용하여 3일 간격으로 교체하여 연골세포로의 분화를 유도.
  5. 분화유도된 연골조직은 4% paraformaldehyde를 포함하는 PBS 용액으로 24시간 동안 4℃에서 고정하고, 파라핀 포매과정을 거처 microtome으로 5㎛ 두께로 절편.
  6. 얻어진 절편은 파라핀제거과정을 거쳐, Alcian blue 염색액에 10분간 염색.
  7. Alcian blue 염색 후 PBS 용액으로 2회 세척 후 nuclear fast red 용액으로 5분간 대조염색.
  8. 대조염색 후 PBS 용액으로 3회 세척한 후 광학현미경하에서 푸른색으로 염색된 연골세포의 세포외 기질을 관찰.

6. 뼈세포로의 분화 유도 및 확인
  1. 수집한 분획의 SVF를 10% FBS, 0.2% Fungizone, 1% Penicillin Streptomycin가 첨가된 DMEM에 배양.
  2. 100% confluency가 될 때까지 배양한 후, 배지를 뼈세포 분화 유도 배지 (10mM β-Glycerophosphate disodium salt hydrate, 0.2mM L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate, 10nM Dexa과 10% FBS가첨가된 DMEM 배지)로 교체하여 2주일간 배양한다. 이때 배양액은 뼈세포 분화 유도배지를 이용하여 3일 간격으로 교체.
  3. 2주 후 배지를 모두 제거하고, 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 용액으로 세척한 4% paraformaldehyde를 포함하는 PBS 용액으로 실온에서 10분간 세포를 고정.
  4. 고정 후 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 세포외에 축적된 광물질은 von kossa 염색을 통해 관찰하여 뼈세포로의 분화를 확인.
  5. von kossa 염색에 고정된 세포를 세척한 후, 1% silver nitrate 용액을 세포에 도포한 후 자외선하에서 45분간 방치.
  6. 증류수로 2회 세척하고, 3% sodium thiosulphate 용액을 가하고 5분간 반응.
  7. 증류수로 2회 세척한 후, 광학현미경하에서 세포바깥에 검정색으로 염색된 무기물질의 침착 여부를 관찰하여 뼈세포로의 분화를 확인.

참고문헌
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