혈관평활근세포 (VSMC) 분리 및 실험 응용
이병완

연세의대
1. 혈관평활근 세포 연구의 실험적 의의
혈관병변을 일으키는 혈중 물질, 혈류역학적 인자, 혈관 벽의 수축과 확장 등의 운동과 혈관 벽의 주요 구성 세포인 평활근세포간의 반응을 경시적, 정량적으로 관찰할 수 있게 되어 혈관 질환 규명의 유력한 수단이다.

2. 혈관평활근 세포의 특성
1) 현미경 소견
위상차 현미경으로 보면 평활근세포는 ‘hills and valleys' 모양으로 배열된다(그림 1). 그러나 3∼5개월 된 Sprague-Dawley 쥐의 대동맥에서 채취 배양한 소위 ‘adult-derived' 평활근 세포는 전형적 ‘hills and valleys' 소견을 보이는데 반해 3∼4일된 SD 쥐의 대동맥에서 구한 ‘pup-derived'평활근세포는 내피세포와 같이 ‘cobblestone' 모양을 보이고 외부의 성장인자가 없어도 성장이 가능하다. 2) 평활근세포의 표현형: 수축형과 합성형 평활근세포의 표현형은 두 가지가 있다고 본다. 즉 수축형과 합성형이다. 전자현미경으로 관찰하면 수축형은 선조가 풍부하여 수축 기능을 갖고 있고, 합성형은 선조가 적고 미토콘드리아와 조면소포체가 풍부하여 물질 합성이 왕성하다.
정상동맥의 중막 평활근세포는 수축형으로 혈청 등의 증식자극에 반응하지 않는다. 주유자극에도 반응하지 않는다. 생체 내에서는 화학적 또는 물리학적 자극에 반응하여 중막 평활근세포가 내막으로 주유하면 합성형으로 변환한다. 이 변환은 중막에서 내막으로 주유하는 도중에 일어난다. 생체 내에선 이 변화는 자극후 수 시간 내에 일어난다. 동맥경화병소 내막에 존재하는 평활근세포는 합성형과 수축형이 혼재해 있다. 중막으로부터 내막으로 주유해 온 세포는 합성형이지만 분열하지 않으면 일부 수축형으로 되돌아간다. 시험관내에서는 혈청자극에 의해 1주정도 지나면 수축형은 합성형으로 변환한다. Fibronectin은 이것을 촉진하는 인자이다. 혈청 내에는 다량의 fibronectin이 들어 있다. 배양 초기에는 confluence 상태가 되면 합성형 평활근세포는 다시 수축형으로 되돌아간다. 그러나 계대를 거치면서 confluence 되어도 합성형으로 남는다. 헤파린은 이 변환을 억제한다. 합성형에서 수축형에로의 변환인자로서 엘라스틴, 라미닌, I형 콜라겐, TGF-β 등이 거론되지만 자세한 검토가 필요하다. 대식세포와 수축형 평활근세포의 co-culture는 합성형에의 변환을 촉진시키는데, 이는 평활근세포의 matrix속의heparan sulfate가 이 변환을 억제는 것을 대식세포가 분비한 헤파리나제가 heparan sulfate를 분해하기 때문으로 이해하고 있다. 합성형 평활근세포는 주유인자, 증식인자에 잘 반응한다.

3. 효소처리 혈관평활근세포 초대 배양법
효소 이용법으로 쥐 대동맥 혈관평활근세포를 채취 배양하는 실험을 기술한다.
우선 실험에 쓰일 효소 I액(이하 I액이라 함)과 II액을 조제한다.
1) 효소 조제
(1) I액 만들기
HBS 용액에 collagenase type I과 elastase type III를 최종 농도가 collagenase type I 1mg/mL, elastase type III 5unit/mL 되도록 섞은 후 syringe filter로 여과한 뒤 얼음에 세워둔다.
(2) II액 만들기
HBS 용액에 collagenase type I과 elastase type III를 최종 농도가 collagenase type I 1mg/mL, elastase type III 15unit/mL 되도록 섞은 후 syringe filter로 여과한 뒤 얼음에 세워둔다.

2) 동맥 채취
동맥중막 및 내막 평활근세포의 배양에는 일반적으로 흉대동맥이 이용된다. 원숭이, 돼지, 토끼, 쥐 등의 동물을 이용하는 경우에는 동물의 털에 붙어 있는 세균을 철저히 소독한 뒤에 실시한다. Ether 마취하에 무균적으로 대동맥을 채취한 후 핀셋으로 대동맥 주위를 잘 박리하여 가능한 길게 떼어 내어 Hanks 용액에 넣은후 떼어낸 대동맥 주위에 붙어 있는 조직을 작은 핀셋으로 가볍게 제거하고 속의 혈액도 핀셋으로 가볍게 잡아 짜내어 빼낸 뒤 새로운 Hanks 용액에 옮긴다.

3) I액 처리와 외막 박리
(1) waterbath의 온도가 37℃인가 확인한다.
(2) 대동맥을 각각 I액에 옮겨 30분간 waterbath에 둔다.
(3) Shaking waterbath에 넣는다. 도중에 1∼2회 손으로 흔들어 준다.
(4) 30분 후 대동맥을 꺼내어 새 Hanks 용액에 넣는다.
(5) 외막을 대동맥 끝에서 부터 또는 절단된 중앙 부터 벗긴다. 핀셋 두 개로 가능한 신속히, 무균적으로 실시한다.
(6) 길이를 3∼5mm씩으로 자른 뒤 새 Hanks액에 옮긴다.

4) II액 처리와 세포분산
(1) 대동맥을 효소 II액이 담긴 tube에 옮겨 120분간 waterbath에 둔다.
(2) 도중에 5∼8회 손으로 흔들어 준다.
(3) 4℃, 1000rpm으로 3∼5분간 원심분리 한다.
(4) 상청액을 흡인 제거한다.
(5) 10ml 피펫으로 10% FBS DMEM을 따서, 상청액이 제거되고 세포가 가라 앉아 있는 tube에 가능한 조용히 넣는다.
(6) 5mL 또는 10ml피펫으로 tube 바닥의 세포를 조용히 흡인하여 튜브의 액면상에 얌전히 배출시킨다. 이 동작을 3회 이상 잘 반복하면 효과적으로 세포를 얻을 수 있다.
(7) 10ml 피펫으로 액을 조심스럽게 petridish 또는 플라스크에 분배한다.
(8) 10% FBS DMEM을 사용하는 배지 용기에 알맞게 추가 주입한다.
(9) 배양 용기에 날짜를 기입 확인하고 CO2 배양기에 넣는다.
(10) 배양실험일지에 일자, 시각을 기록한다.
(11) 72시간 뒤에 배양 상태를 확인한다.

Reference
  1. 유형준: 혈관평활근세포 배양 실험 기술. pp. 46-4 In: 당뇨병: 혈관세포 배양 기술과 응용 (제2판), 골드기획, 서울, 2007
  2. Rzucidlo EM et.al Regulation of vascular smooth muscle cell differentiation. J Vasc Surg. 2007 Jun;45 Suppl A:A25-32
  3. Lee BW et al. Amadori-glycated albumin-induced vascular smooth muscle cell proliferation and expression of inhibitor of apoptosis protein-1 and nerve growth factor-gamma. Biofactors. 2007;31(3-4):145-53