일차 간세포 분리 및 배양 기술
고은희

울산의대
간실질 (parenchymal hepatocyte) 세포는 비병적조건에서 간의 총 80%를 차지한다. 이외에도 비실질세포인 kuppfer cell, 담관상피세포, 혈관상피세포, 섬유아세포 등 다양한 세포들이 간 조직을 구성한다.
일차 간세포 배양은 다양한 간내 physiology 및 pathology 연구를 위해 유용한 방법이다. 일반적으로 in vitro에서 HepG2 cell 등을 이용한 세포 배양이 취급하기는 간단하기는 하나, 암세포이기 때문에 효소의 발현이 정상 세포와는 다르게 나타나며 약물 등을 처리시 세포 사멸 및 hormone에 대한 응답능이 낮아 간기능을 대상으로 하는 연구에 부적절한 경우가 많다. 일차 배양 세포 시험의 경우는 정상동물에서 분리한 조직 세포를 배양하게 되므로 in vivo 상태에서와 유사한 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다.

본 강의에서는 관류법에 의한 mouse 간세포 분리에 대하여 간단히 설명하고자 한다.
이 방법은 1969년에 Berry와 Friend에 의해 발표되어 최근 대부분의 연구자들이 이 방법에 준하여 실험을 하고 있다.

세포 분리 조작에 필요한 기구 및 시약류는 다음과 같다.
  1. EBSS 500 mL
  2. 50mM EGTA
  3. HBSS w/o Ca,/Mg
  4. 40 mg/mL Trypsin inhibitor stock (250mg in 6.5ml H2O) (Sigma T-2011): 125 μL씩 분주하여 냉동 (20도)
  5. 300 mg/mL collagenase stock (1g in 3mL H2O)(Gibco BRL 17101-015): 125 uL씩 분주하여 냉동 (20도)
  6. Culture Media
    A. Williams’ Medium E (Gibco #12551-032) 500 mL
    B. 1mM Triamcinolone acetonide 50 uL
    C. 10 mg/mL Insulin 100 uL (final concentration 10 ug/mL)
    D. Penicillin/Streptomycin
  7. Collagen coated plates :
    A. collagen (Boehringer Mannheim Biochemica # 1 179 179)
    B. 0.1M NaHCO3
    C. 6 cm dish
    D. PBS
  8. Percoll (sigma P4937)
  9. 100% Polyester monofilament
  10. Funnel
  11. Cotton-tip swab (sterile)
  12. Dissector/고정핀/고정판
  13. Tissue culture scraper
  14. 60mm, 100mm dish
  15. Infusion pump
    70% EtOH washing
    Scalp needle, 수액세트
    Water bath (37도), Centrifuge (cfg. 500~600 rpm, 3min, in 50mL tube)
    삼각 플라스크 200mL 2개, 500 mL 비이커, 500 mL 공병 2개
    보온 스티로폼 박스,
방법을 아래와 같이 간단히 요약, 해설하여 본다.
  1. EBSS 500 mL + 50mM EGTA 5 mL
  2. HBSS w/o Ca/Mg 50 mL + 40 mg/mL Trypsin inhibitor (Sigma T-2011) 60 uL + 300 mg/L collagenase 60 uL ; 사용직전 mix
  3. Culture Media
    A. Williams’ Medium E (Gibco #12551-032) 500 mL
    B. 1mM Triamcinolone acetonide 50 uL
    C. 10 mg/mL Insulin 100 uL (final conc 10 ug/mL)
    D. Penicillin/Streptomycin
  4. collagen-coated plates : collagen (Boehringer Mannheim Biochemica # 1 179 179)
    - 실험하기 전날 준비
    A. dilute w 0.1M NaHCO3 (1:200, final 10 ug/mL)
    B. add to plates ? RT 30min~2h
    C. PBS WASHING (TWICE)
  5. Infusion pump preparation : 70% EtOH washing ?> water wash ?> pre-warmed EBSS/EGTA (1)
  6. HBSS/TA/Collagenase 50mL loading 준비
  7. Scalp needle (나비바늘)로 찌르기 직전 pump 잠시 on (remove air)
  8. Mice를 마취후 수술 대 위에 눕혀 수술용 가위로 개복 후 portal area를 충분히 노출시킨다. 문맥의 절개부에 scalp needle를 삽입하여 봉합사로 결찰한 후 동시에 복부하대 정맥을 절단하여 관류액 및 혈액을 방출시킨다. HBSS/TA/Collagenase solution 모두 들어간 후 liver 적출 (solution 37도 유지)
  9. Simple Williams’ Medium E 에서 liver massage, washing 진행
  10. 50 ml conical tube위에 100 um size의 mesh filter (BD falcon, #352360)를 얹고 filter에 cell을 통과 시킴. 그리고 cfg. 500~600 시행
  11. 이 때, percoll 15mL + PBS 10 mL 섞어 cfg 시행 (gradient 미리 형성)
  12. WME 20mL에 cell pellet 부유 후 준비된 percoll tube 에 조심스레 세포 이동? tube 벽면에 pipet을 대고 천천히 tube를 돌려가면서 진행 너무 빠르게 넣으면 cell이 많이 죽음 ? 살며시 Up & down 3 회 시행후 cfg 500~600 rpm, 10 min
  13. Pellet washing w WME (twice)
  14. Final medium addition : WME+TA+Ins+P/S
  15. Cell count & splitting (collagen-caoted plates)
참고문헌
1. 이재담 등. 조직세포 배양법, 군자출판사, 1994년
2. Wang et al., Primary hepatocyte culture in collagen gel mixture and collagen sandwich. World J Gatroenterol. 2004; 10: 699-207.
3. Mitaka T. The current status of primary hepatocyte culture. Int. J. Exp. Path. 1998; 79: 393-409.