Live animal 모델을 이용한 인슐린 저항성 평가
- 쥐 모델에서 clamp 연구-
홍은경

한림의대
인슐린저항성은 1960년 S Yalow와 Berson 등이 당뇨병환자에서 인슐린 분비가 감소되어 있을 것이란 초기 예상과 달리 높은 인슐린 농도를 관찰함으로써 처음 보고하였다. 인슐린이 특정 조직에서 적절히 작용하지 못하는 현상에 따라 점진적인 혈당 상승의 원인이 되기도 하는 인슐린 저항성은 제2형 당뇨병뿐 아니라 1형 당뇨병에도 동반되는 현상으로 1970년대 많은 연구자들의 주요 연구 과제가 되었다. 인슐린저항성을 연구하는 방법은 현재 사람 및 동물에서 다양한 방법들이 사용되고 있다. 그러나 현재 사용할 수 있는 인슐린저항성 측정 방법들은 전체적인 현상으로써의 양적 측정이 가능한 정도이며 실제 인슐린저항성 발생에서 주요한 장기 및 조직들이 어떠한 역할을 하는지 알 수 없다. 다양한 인슐린저항성 측정 방법들 중 고인슐린 정상혈당 클램프 연구(hyperinsulinemic-euglycemic clamp technique)은 특히 생체에서 전체적인 그리고 각 장기별 인슐린 민감도를 측정할 수 있는 방법으로 본 워크샾에서는 생쥐에서의 실험을 위주로 그 방법을 설명하고자 한다.
Clamp technique 은 internal jugular vein에 관을 연결하여 외부에서 인슐린, 당, 및 방사선 동위원소가 결합된 당을 주입하여 인슐린에 의한 전신적 포도당 섭취 및 특정조직에서의 이용률을 측정할 수 있으며 간에서는 기저상태 및 인슐린 자극하에서의 당생성을 측정할 수 있다.

1. 생쥐 수술
클램프 실험을 위한 생쥐들은 실험 약 5-7일 전 internal jugular vein에 silicone tube 삽관 수술을 실시하여 각기 다른 cage에서 넣어 수술후 체중 감소 및 스트레스를 회복할 수 있도록 유지한다. 수술은 생쥐 무게를 측정하여 체중당 계산된 마취제(Ketamine: Xylazine mix)를 복강으로 주입하고 생쥐의 reflex 들이 사라진 시점에 삽관하고자 하는 Internal jugular vein 위쪽 경부의 피부를 조금 절개하고 피하 조직 및 혈관 주변의 지방조직들을 제거하여 혈관이 노츨되면 머리쪽 부위를 묶어 혈액 순환을 차단하고 심장쪽에서 들어오는 쪽 은 절개하여 미리 준비된 관을 삽입하고 혈관과 함께 묶어 고정한다. 등쪽 목에 가까운 부위에 작은 구멍을 만들어 조심히 피하로 관을 통과 시켜 등의 절개한 틈으로 관을 빼내어 끝은 시로 묶은 후 다시 피하에 넣어 유지한다.

2. 클램프 준비 및 실험 방법
클램프를 위한 시료들 중 방사선 동위원소는 최소 2일전에 (1) basal period infusion (F1): 한 마리당 유리관에 3H glucose 9 ?Ci를 넣고 용매증발, (2) clamp infusion (F2): 한 마리당 유리관에 3H glucose 18 ?Ci를 넣고 용매증발, (3) 3H glucose는 용매 증발 후 각각 600 ?l의 saline 넣고 녹임, (4) 14C-DG: 한 마리당 injection 하는 양은 10 ?Ci/10 ?l. 세네마리 용을 같이 제작하여 여유분을 더하여 줌 등을 각각 준비해 놓는다. 실험 당일 혈액 채취를 위해서는 혈장 방사선 동위원소 (tracer) 분석용 tube 준비롤 500 ?l microcentrifuge tube에 F1은, 80, 85, 90, 100, 110, 120을 marking 하고 증류수 20 ?l를 넣어두고, F2는 marking 하고 증류수 60 ?l를 넣는다.

클램프 실험 하루 전날 저녁 cage에 물을 제외한 먹이를 모두 제거하여 약 12시간 정도 금식할 수 있도록 관리한다.
실험 당일 날 생쥐들은 각각 원통형의 투명 관속에 넣어 도망가지 못하도록 유지하고 등에 넣어둔 관을 꺼내기 Three way connector에 연결한다. 쥐의 꼬리를 잘라 혈액 약 10-15??l를 채혈 (microhematocrit capillary tube 이용)하고 태이프를 붙여 출혈이 되지 않도록 막아둔다. 채취한 혈액은 원심분리하여 혈장을 준비해 두고 인슐린 주입액에 섞어 준비해둔다.
이후 2 시간 동안 F1을 microdialysis pump를 이용하여 속도 3.3 ?l/min로 주입하고 F1을 주입하는 동안 인슐린과 F2를 제작한다. 인슐린 주입액은 Saline 990 ?l에 인슐린(100 U/ml) 10 ?l넣어 vortex (100 배 희석)하고 희석된 인슐린을 다시 두 배 희석하여 원액의 200배 희석된 인슐린으로 제작하여 1 ml syringe에 loading (priming insulin)한다. 100 배 희석된 인슐린은 실험하는 생쥐의 BW (kg)에 455 곱하여 나온 양 만큼의 ?l를 파이펫으로 혈장을 미리 섞은 F2에 넣고 vortex하여 준비해 둔다. Clamp 시작 30분전 표준화 용액 (150 mg/dl)을 사용하여 glucose analyzer 2를 calculation하고 2시간 동안의 F1주입이 끝난 후 채혈하여 혈당을 측정하고 기저 인슐린 및 지방 측정용 혈액도 채취한다. Pump의 주입 주사기를 20% 포도당 주입용 주사기와 200 배 희석한 인슐린을 넣은 주사기로 교체하고 클램프를 시작한다.

먼저 3분간 200배 희석한 인슐린을 주입하면서 20% 포도당 용액도 함께 주입한 후, 3 분 후 인슐린을 F2로 바꾸고 pump 속도는 다시 3.3 ?l/min로 맞추고 20% 포도당은 같은 속도로 지속적으로 주입한다. 이후 20, 40, 60, 70 분에 채혈하여 혈당 측정하면서 포도당의 주입 속도를 조절 하게 되는데 가능한 정상혈당을 유지하고 포도당 주입속도를 크게 변화하지 않도록 조절하는 것이 가장 중요하다. 클램프 시작후 75 분에 14C deoxyglucose를 주입하고 80, 85, 90, 100, 110, 120 분에 tracer 측정용 혈장 10 ?l을 채취하여 분석전까지 -20 ℃ 보관하고 100, 110, 120분에 혈당 측정 및 100-120에 clamp중의 인슐린 및 지방 측정용 혈장도 채취하여 -80℃에 보관한다.

클램프 실험이 끝난 생쥐는 마취약 주입후 각각의 조직을 채취하여 곧 바로 liquid nitrogen에 얼려서 -80 ℃ 보관한다. 실험 일 얻은 혈액들은 whole body glucose turn over를 결정하기 위해 된 tracer 량을 측정하고 미리 준비해둔 조직은 anion exchange column을 이용하여 14C-2-deoxyglucose-6 phosphate를 분리함으로써 조직에 섭취된 포도당을 측정하고 혈액내의 동위원소 변화량과 비교하여 이용률을 계산해 낸다.

참고문헌
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