Incretin Study - Translational and Clinical 조영민 서울대학교 의과대학 내과학교실 인크레틴은 영양소가 위장관을 통해 흡수될 때 위장관내분비세포에서 분비되어 췌장베타세포로부터 인슐린 분비를 촉진하는 호르몬이다. 현재까지 알려져 있는 인크레틴을 두 가지로서 K-cell에서 분비되는 glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP)와 L-cell에서 분비되는 glucagon-like peptide-1 (GLP-1)이 이에 해당한다. 인크레틴을 이해하기 위해서는 우선 장-췌도 축 (enteroinsular axis)을 알아야 하는데, 이는 우리가 음식물을 먹었을 때 인슐린이 분비되는 기전을 설명하는 모델이다. 음식물이 소화 흡수되는 과정에서 (1) 영양소인 포도당이나 지방산 자체가 베타세포에 도달하여 인슐린 분비를 직접 야기하는 메커니즘, (2) 위장관 내분비세포에서 인크레틴을 분비시켜 인슐린 분비를 일으키는 메커니즘, (3) 신경계를 경유하여 인슐린 분비를 일으키는 메커니즘이 장-췌도 축을 구성한다. 그렇다면 포도당 섭취 후의 인슐린 분비과정에서 인크레틴의 작용을 분리해서 보려면 어떻게 해야 할까? 첫째로, 경구포도당 부하 후의 혈당 반응 데이터를 얻고 이후에 이와 똑 같은 혈당 프로필을 정맥으로 포도당을 주입하여 재현함으로써 혈당 농도에 독립적으로 인크레틴의 기여도를 평가할 수 있을 것이다. 왜냐하면 인크레틴은 오직 영양소가 장에서 흡수될 때만 분비가 증가하기 때문이다. 둘째로, 고혈당 클램프를 하여 일정한 혈당을 유지하게 한 상태로, 경구 포도당을 투여하고 그 이후의 혈당도 경구 포도당 투여 전과 마찬가지로 클램프하여 유지하게 되면, 역시 혈당과는 무관하게 인크레틴 효과만을 구할 수가 있다. 다음으로 인크레틴의 일중 변동을 확인하는 것도 중요한데, 식사에 의해서만 분비가 조절되는지, 그리고 음식을 먹기 전에 소위 cephalic phase에 분비가 일어나지는 않는지도 확인할 필요가 있다. 이번 워크샵에서는 이러한 인크레틴과 관련된 연구 방법론에 대해서 설명하고자 한다. (1) 경구포도당 부하검사   1. 준비물     1) 검사기구 : 혈압계, 줄자, 체중계,         Extension line, Angio cath 18G, Angio cath 20G, 10cc syringes,     50cc syringes, Tourniquet, 3-way,      Eppendorf tubes, Ice box,     Glucose analyzer (YSI 2300 stat plus)     2) 시약 : 75g gluorange, DPP4 inhibitor, heparin 25000U   2. 검사방법     10시간 이상의 금식을 한 상태에서 오전 8:00 임상의학연구소를 방문하도록 한다.     신장, 체중, 허리둘레, 엉덩이둘레, 혈압, 맥박수를 측정하여 기록한다.     Antecubital vein에 18G iv line 을 잡고 3-way을 연결하여 sample을 시행할 준비를 한다.     Labeling이 된 EDTA bottle에는 각각 DPP4 inhibitor를 40ul씩 첨가하여 얼음이 담긴 box 에 미리 준비한다. 1:100으로 mix로 Heparin을 syringe에 묻혀 준비한다.     0분을 기준으로 일반 혈액 검사(HbA1c, Total cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride)를 위한 sample 을 EDTA(2cc), SST(3cc) 채혈한다. 동시에 8.5ml 채혈을 하고, 4ml씩 EDTA bottle 2개에 나누어 담는다. 남은 0.5ml의 혈액으로 glucose analyzer 를 사용하여 혈당을 측정하여 기록한다.     0분째 샘플이 되면, 미리 차게 냉장보관 해둔 75g gluorange을 5분 이내 섭취하도록 한다. (Gluorange를 마시기 시작하는 순간이 0분이다.)     3시간동안 5분마다 0.5ml씩 채혈을 하여 혈당을 측정하여 기록해두고 15, 30, 60, 90, 120, 180 분에 검사를 위한 8ml의 추가 채혈을 하여 EDTA bottle (각 4ml) 2개에 나누어 담는다.     채혈시작 30분, 1시간, 2시간 간격으로 활력징후를 체크한다.     180분째 샘플이 끝나면, iv line 을 제거하고 지혈한다. (2) IIGI (isoglycemic intravenous glucose infusion)   1) 준비물 : 혈압계, 줄자, 체중계,     Extension line, Angio cath 18G, Angio cath 20G,     2cc syringes, 10cc syringes, 50cc syringes     Tourniquet, 3-way,     Eppendorf tubes 1.5ml, Ice box,     Pumps (Harvard Apparatus pump )   2) 시약 : 20% 포도당용액, 생리식염수, DPP4 inhibitor   3) 검사방법     10시간 이상의 금식을 한 상태에서 오전 8:00 임상의학연구소를 방문하도록 한다.     신장, 체중, 허리둘레, 엉덩이둘레, 혈압, 맥박수를 측정하여 기록한다.     양쪽 팔의 Antecubital vein에 18G iv line 을 잡고 한쪽은 3-way을 연결하여 sample을 시행할 준비를 하고, 나머지 한쪽 팔에는 포도당용액이 들어갈 18G iv line을 확보한다.     20% 포도당 용액을 채운 50cc syringe 2개를 Harvard apparatus pump 에 장착하고, extension line 으로 syringe 와 피험자의 정맥에 연결한다.     0분을 기준으로 일반 혈액 검사(HbA1c, Total cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride)를 위한 sample 을 EDTA(2cc), SST(3cc) 채혈한다. 동시에 8.5ml 채혈을 하고, 4ml씩 EDTA bottle 2개에 나누어 담는다. 남은 0.5ml의 혈액으로 glucose analyzer 를 사용하여 혈당을 측정하여 기록한다.     3시간동안 5분마다 0.5ml씩 채혈을 하여 혈당을 측정하여 기록해두고 15, 30, 60, 90, 120, 180 분에 검사를 위한 8ml의 추가 채혈을 하여 EDTA bottle 2개에 뚜껑을 열어 나누어 담는다. 채혈시작 30분, 1시간, 2시간 간격으로 활력징후를 체크한다. 180분째 샘플이 끝나면, iv line 을 제거하고 지혈한다.   4) 포도당 주입 속도 조절의 요령: 첫 5분 동안의 20% 포도당 주입속도 결정은 정상인의 경우 공복혈당이 80-90mg/dl인 경우 0.8-1.0 ml/min 으로 시작하고 5분마다 혈당값을 확인하여 OGTT때의 혈당값을 비교 후 포도당 주입속도를 서서히 증감한다. 대개 이전 포도당 주입속도의 30-40%만큼씩 증가시키며, 만일 목표로 하는 OGTT 혈당값을 넘어서는 경우에는 주입속도를 20-30% 줄인다. OGTT의 최고치 혈당에 도달한 이후는 20%씩 감량해 나간다. 만일 최고치 혈당 도달값이 OGTT의 최고치 혈당값을 약 15mg/dl이상 넘어서는 경우에는 일단 주입을 5분간 중단한 후 이전 주입속도의 80%수준에서 다시 주입을 시작한다. 이후 20-30% 씩 직전 주입 속도로부터 줄여나가면 문제없이 맞출 수 있다. 120분 이후로는 혈당을 20분 간격으로 측정하기 때문에 예상했던 혈당값보다 낮게 측정 될 것을 대비해 중간에 혈당 측정을 하도록 한다. 떨어지는 혈당의 폭이 큰 경우 중간중간 포도당을 주입을 해주도록 한다. 일일이 자세한 내용을 글로 표현하기는 어려운데, 실험자의 “감”에 의존하는 경우가 많으므로 시행착오를 통해 경험을 쌓는 것이 필요하다. (3) The hyperglycemic clamp with an oral glucose load   1) 준비물 : 혈압계, 줄자, 체중계,     Extension line, Angio cath 18G, Angio cath 20G, 10cc syringes,     60cc syringes, EDTA bottle 10cc,     Tourniquet, 3-way,     Eppendorf tubes 1.5ml, Ice box, 손목 찜질기 또는 hot box (custom-made),     Glucose analyzer (YSI 2300 stat plus), Pumps (Harvard Apparatus pump ), 소변통   2) 시약 : 2 75g gluorange, DPP4 inhibitor, heparin 25000U, 20% 포도당용액, Aprotinin   3) 검사방법     10시간 이상의 금식을 한 상태에서 오전 8:00 임상의학연구소를 방문하도록 한다.     신장, 체중, 허리둘레, 엉덩이둘레, 혈압, 맥박수를 측정하여 기록한다.     양쪽 팔에 18G iv line를 이용하여 line을 잡는다. 포도당을 주입할 쪽은 반드시 18G를 이용하여 팔오금 부위에 (심장에 가깝게)잡고, 채혈용은 반대쪽 손등에 잡는데 이때 바늘을(18G)넣는 방향은 일반적으로 주사하는 것과 반대방향으로 한다.     sample을 위한 vein은 3-way을 연결하여 sample을 시행할 준비를 하고, 포도당이 주입될 vein은 20% 포도당 용액을 채운 60cc syringe로 변경 2개를 Harvard apparatus pump 에 장착하고, extension line으로 syringe와 피험자의 정맥에 연결한다.     Sample을 위해 정맥 케뉼라를 거치한 손은 타월로 감싼 채로 섭씨 70도의 손목 찜질기에 sample이 용이하게 위치시킨다 (또는 hot box 이용).     1:100으로 mix된 Heparin을 syringe에 묻혀 준비한다.     Labeling이 된 EDTA bottle에는 각각 DPP4 inhibitor를 첨가한다.     Hyperglycemic clamp는 DeFronzo가 개발한 프로토콜을 그대로 이용한다 (이에 대해서는 워크샵에서 자세히 설명하고자 한다). 첫 15분 동안 포도당을 1분단위로 주입시키기 위해 환자의 키와 몸무게를 입력하여 나온 프로그래밍 값을 Harvard pump에 입력한다. 5분마다 0.5ml씩 채혈을 하여 혈당을 측정하여 기록한다. 혈당을 측정하여 혈당값이 280mg/dl을 목표로 일정하게 포도당을 5분 간격으로 주입을 한다. 실제 DeFronzo 프로토콜대로 수행할 경우 대개의 경우 잘 맞지만 그렇지 않은 경우에는 연구자의 경험과 감에 따라 주입 속도를 약간 변경해 보면 성공적으로 수행이 가능하다.     60분째 9ml 샘플을 위해 채혈한다. 이후 미리 차게 냉장보관 해둔 75g gluorange을 5분 이내 섭취하도록 한다. Gluorange를 마시기 시작하는 순간이 60분이다.     이후의 고혈당 클램프도 동일한 방법으로 수행하면 대개 문제없이 일정한 혈당을 유지할 수 있다.     채혈시작 30분, 1시간, 2시간 간격으로 활력징후를 체크한다. 180분째 샘플이 끝나면, iv line 을 제거하고 지혈한다.     실험을 종료한 후 실험 중 받은 소변을 YSI 2300기계를 이용하여 소변에서 혈당 측정하도록 한다 (실험 중 고혈당으로 인한 배뇨와 관련하여 배뇨시간과 배뇨량을 측정하고 소변에서 0.5ml를 EP tube 따로 담아 YSI2300을 이용하여 소변에서의 포도당 농도를 체크한다).